Laboratorio di Neurobiologia Molecolare e Cellulare

Responsabile scientifico Daniela Merlo

Responsabile

Daniela Merlo

 

Staff

 

Leonardo Lupacchini

 

Tecnologie e Metodiche di laboratorio

 

 

Tecniche di Biologia Molecolare: clonaggi, Real-Time PCR, Southern Blot, Northern Blot, RNA interference, generazione di topi transgenici.

 

Tecniche di Biologia cellulare: colture cellulari (linee cellulari e colture neuronali primarie), tecniche di transdiferenziamento da fibroblasti a cellule neuronali, transfezione transiente e stabile di cellule di mammifero, infezione mediata da adenovirus associati, immunoistochimica, immunocitochimica e microscopia confocale.

 

Tecniche di Biochimica: espressione e purificazione di proteine di fusione in batteri, saggi immunoenzimatici (ELISA), analisi di proteine (immunoprecipitazione, Western Blot, marcatura metabolica, pulse and chase, saggi di biotinilazione per lo studio del traffico dei recettori di membrana, saggi chinasici).

 

Interessi di ricerca

 

 

Ruolo delle proteine coinvolte nella riparazione del DNA nella neurodegenerazione e nella plasticità sinaptica.

 

Sviluppo e validazione di nuove strategie diagnostiche molecolari per le demenze.

 

Chemical-induced neurons derivanti da fibroblasti sia di modelli animali che di pazienti per studi di patogenesi e test farmacologici e medicina personalizzata.

 

Progetti Di Ricerca

Sviluppo di strategie terapeutiche innovative, basate sulla stimolazione della riparazione del DNA, per le malattie neurodegenerative ed il declino cognitivo legato all’invecchiamento.

 

L’accumulo di danni al DNA così come la presenza di difetti nei meccanismi di riparazione del DNA possono contribuire alla morte neuronale osservata nell’invecchiamento e in importanti patologie neurodegenerative, inclusa la malattia di Alzheimer (AD). La DNA-PK è una serina/treonina chinasi essenziale per la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA (DSBs) mediante Not Homologous End Joining (NHEJ). Sebbene la DNA-PK sia una proteina prevalentemente nucleare, alcuni studi hanno dimostrato come quantità significative di questa proteina siano presenti a livello delle membrane cellulari, suggerendo un ruolo alternativo a quello di riparazione del DNA. Dati preliminari del nostro laboratorio mostrano infatti come la DNA-PK sia presente nelle membrane sinaptiche di ippocampo e corteccia, sia  murina che umana, e sia in grado di legare diverse proteine coinvolte nella plasticità sinaptica. Esperimenti effettuati su un modello murino difettivo per l’attività funzionale della DNA-PK (topi KO DNA-PKcs -/-), hanno inoltre mostrato come il potenziamento a lungo termine (LTP), correlato elettrofisiologico dei processi di apprendimento e memoria, sia fortemente ridotto nei topi KO. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato come l’applicazione di dosi subletali del peptide beta amiloide sia in grado di inibire l’attività chinasica della proteina DNA-PK in cellule postmitotiche, inibendo la NHEJ e rendendo le cellule postmitotiche più suscettibili a condizioni non letali di stress ossidativo (Cardinale et al., 2012). Infine, poiche è stato recentemente  dimostrato che l’ attività neuronale determina la formazione di DSBs che permettono a loro volta l’espressione di Early Responsive Genes (ERGs, Fos and Egr1), abbiamo studiato l’effetto dell’assenza della DNA-PKcs sull’espressione di tali geni  in neuroni corticali. I risultati indicano che la mancata riparazione dei DSBs influenza la cinetica di espressione degli ERGs, geni fondamentali nel controllo dei meccanismi alla base della memoria.

Complessivamente, i dati ottenuti suggeriscono pertanto un ruolo della DNA-PK nella patogenesi di AD e nei deficit cognitivi associati a tale patologia e prospettano l’aumento della sua attività come un nuovo potenziale approccio terapeutico.

 

I fattori di riparazione del DNA come potenziali biomarcatori della malattia di Alzheimer

 

In questi anni abbiamo valutato il coinvolgimento del complesso della DNA-PK e dell’attività di NHEJ da esso mediata nella patogenesi dell’AD ed abbiamo valutato la potenzialità di questo complesso come biomarcatore periferico di patologia.  A questo scopo abbiamo analizzato i livelli di espressione delle proteine Ku 70, Ku 86 e DNA-PKcs su cellule PBMC derivanti dal sangue periferico di pazienti AD di grado moderato-severo. I risultati preliminari derivanti da queste analisi hanno mostrato una riduzione significativa dei livelli proteici nucleari dell’eterodimero Ku nel 40-50 % dei pazienti AD rispetto ai soggetti di controllo. E’ ben noto come l’eterodimero Ku70/Ku86 sia essenziale per l’attività chinasica della DNA-PKcs così come per la riparazione dei DSBs. Queste proteine sono modulate dallo stress ossidativo, un fattore importante nella patogenesi dell’AD. Anche se i meccanismi alla base della disfunzione del bilancio redox non sono noti, il misfolding proteico e l’aggregazione delle proteine amiloidogeniche (i.e. l’Abeta 1-42 nell’AD) sembrano essere coinvolte in questo processo. La nostra ipotesi è che lo stress ossidativo associato all’accumulo dell’Abeta nell’AD e/o alla generazione di conformeri specifici citotossici (i.e. oligomeri) di questo peptide,  possano causare una disfunzione dell’attività di riparazione dei DSBs dipendente dalla DNA-PK. In particolare lo stress ossidativo potrebbe causare la riduzione dell’espressione delle proteine Ku 70/ Ku 86 e/o dell’inibizione dell’attività chinasica della DNA-PKcs (Cardinale et al. 2012). Questi fenomeni ipotizzati a livello periferico potrebbero riflettere i processi patologici in corso nel cervello dove un progressivo accumulo di  Abeta “misfoldato” o in forma oligomerica è comunemente osservato. A riguardo, diverse evidenze sperimentali hanno mostrato una correlazione tra  i livelli di Abeta 1-42 oligomerica presente nel cervello e quelli del sangue periferico in pazienti affetti da AD.

L’obiettivo principale di questo progetto è quello di identificare il complesso della DNA-PK e più in generale della funzionalità della riparazione dei DSBs come nuovi biomarcatori periferici e/o potenziali bersagli terapeutici della malattia di Alzheimer.

 

Neuroni chimicamente derivati da fibroblasti umani

 

La generazione di neuroni umani derivanti dalla diretta conversione di fibroblasti della pelle di pazienti rappresenta uno strumento essenziale per lo sviluppo di modelli alternativi di patologie neurologiche e per applicazioni rilevanti di medicina personalizzata, traslazionale e rigenerativa. Il modello ha le potenzialità di essere usato per testare nuovi approcci diagnostico-terapeutici direttamente su cellule neuronali umane di pazienti affetti da malattie neurologiche rilevanti per il servizio sanitario nazionale.

In particolare, le demenze neurodegenerative sono caratterizzate dalla formazione e accumulo nel SNC di conformeri patologici diversi a secondo del tipo di malattia, beta-amiloide, alfa-sinucleina, tau, e prione che tuttavia non sono facilmente identificabili e misurabili in tessuti biologici facilmente accessibili o nei liquidi biologici. L’obiettivo del progetto è pertanto lo sviluppo di nuovi test diagnostici a basso costo e poco invasivi basati sulla identificazione e quantificazione di questi conformeri proteici in neuroni chimicamente derivati da fibroblasti di pazienti affetti da demenza.

 

Pubblicazioni

 

 

 

1. Cardinale C., Racaniello M., Saladini S., De Chiara G., Mollinari C., Maria Chiara de Stefano M.C., Pocchiari M., Garaci E., Merlo D. “Sublethal doses of b-amyloid peptide abrogate DNA-dependent Protein Kinase activity” (2012) J Biol Chem. 287: 2618-2631.

2. Cardinale A, Merlo D, Giunchedi P, Biocca S. “Therapeutic application of intrabodies against age-related neurodegenerative disorders”. (2014) Curr Pharm Des.20: 6028-6036.

3. Cardinale A., de Stefano MC, Mollinari C., Racaniello M., Garaci E., Merlo D. “Biochemical characterization of Sirtuin 6 in the brain and its involvement in oxidative stress response” (2015). Neurochem Res. 2015 Jan;40: 59-69. doi: 10.1007/s11064-014-1465-1

4. Mollinari C., Racaniello M., Berry A., Pieri M., de Stefano MC, Cardinale A., Zona C, Cirulli F., Garaci E., Merlo D. “miR-34a regulates cell proliferation, morphology and function of newborn neurons resulting in improved behavioural outcomes”. (2015) Cell Death Dis. Jan 29;6:e1622. doi: 10.1038/cddis.2014.589.

5. Merlo D., Mollinari C., Racaniello M., Garaci E. and Cardinale A. “DNA double strand breaks: a common theme in neurodegenerative diseases”. Curr Alzheimer Res. 2016 Apr 1. [Epub ahead of print]

6. D'Arcangelo G., Grossi D., Racaniello M., Cardinale A., ZarattiA., Rufini S., Cutarelli A., Tancredi V., Merlo D. and Frank C. “Miglustat reverts the impairement of synaptic plasticity in a mouse model of NPC disease”. Neural Plast. 2016;2016:3830424. doi: 10.1155/2016/3830424. Epub 2016 Jan 14.

7. Narciso L., Parlanti E., Racaniello M., Simonelli V., Cardinale A., Merlo D. and Dogliotti E. “The response to oxidative DNA damage in neurons: mechanisms and disease”. Neural Plast. 2016;2016:3619274. doi: 10.1155/2016/3619274. Epub 2016 Jan 31.

8. Merlo D., Cuchillo-Ibañez I, Parlato R, Rammes G. “DNA Damage, Neurodegeneration, and Synaptic Plasticity”. Neural Plast. 2016;2016:1206840. doi: 10.1155/2016/1206840. Epub 2016 May 25.

9. De Chiara G, Racaniello M, Mollinari C, Marcocci ME, Aversa G, Cardinale A, Giovannetti A, Palamara AT, Garaci E, Merlo D. “Herpes simplex virus-type1 (HSV-1) impairs DNA repair in cortical neurons, causing accumulation of DNA damage and contributing to neurodegeneration”. Frontiers in Aging Neuroscience. 2016 Oct 18; 8:242

10. (44) Mollinari C., Zhao J., Lupacchini L., Garaci E., Merlo D., Pei G. “Transdifferentiation: a new promise for neurodegenerative diseases”. Cell Death & Disease. 2018 Aug 6;9(8):830. doi: 10.1038/s41419-018-0891-4.