Laboratorio di Epidemiologia Molecolare

Responsabile scientifico Patrizia Russo

 

Responsabile

 

Patrizia Russo

 

 

Staff

 

 

 

Palma Lamonaca

Alessia Santoro

 

Tecnologie e Metodiche di laboratorio

 

 

Separazione di linfociti e monociti da sangue periferico. Separazione di plasma e siero da sangue periferico. Crio-preservazione di campioni biologici quali linfociti e monociti, plasma, siero, urine, lavaggio bronco alveolare (BAL). Colture di cellule primarie e stabilizzate. Microscopia a fluorescenza e colorimetrica. Western blot. Tecniche di biologia molecolare (real time PCR, RT-PCR). Citofluorimetria.

 

Interessi di ricerca

 

 

SYSTEMS MEDICINE

Creazione e validazione di una Piattaforma per sviluppare e studiare modelli innovativi di patologia umana non trasmissibili [BPCO e malattie neurologiche geriatriche (Alzheimer)].

Negli ultimi  decenni si è assistito a un incremento senza precedenti delle possibilità offerte dalle tecnologie “high throughput” in termini di qualità e quantità (oltre che ottimizzazione) della “misura” molecolare e cellulare a livello, soprattutto, genomico e proteomico. Lo sviluppo, in specifico, di tecnologie di analisi sempre più sensibili e sofisticate (genetica, profili, funzionalità, ecc.) richiede la disponibilità di materiale biologico raccolto e trattato secondo tecniche standardizzate sempre più definite ed affidabili in accordo alle attuali procedure europee. Alla luce di queste indicazioni viene realizzata una raccolta di campioni biologici (siero, plasma, linfociti) umani provenienti da pazienti affetti da malattie non trasmissibili, quali ad esempio, BPCO allo scopo di facilitare la traslazione delle informazioni di biologia, in particolare di omica, alla pratica clinica, di permettere una rapida risposta a quesiti sperimentali di potenziale valenza (terapia e/o diagnosi) garantendo la qualità e la quantità di campioni utilizzabili per queste pratiche.

La piattaforma permette di ottimizzare e personalizzare le strategie terapeutiche riabilitative dei pazienti. Vengono studiati metodi per l’individuazione di nuovi farmaci o terapie, marcatori prognostici e di risposta, e test tossicologici e funzionali.

La bio-repository è allestita presso l’IRCCS San Raffaele Pisana e provvede alla conservazione ed al management del materiale di provenienza umana in accordo alle Good Laboratory Practices (GLPs) come definite nella Convenzione di Oviedo e regolato dalla normativa nazionale di riferimento. I dati relativi all’identità del paziente vengono anonimizzati. Ad ogni aliquota verranno associati i dati clinici di riferimento in un archivio computerizzato

Risultati Ottenuti

–  Definizione della piattaforma

–  Costruzione iniziale della rete degli istituti coinvolti (Università Cattolica del Sacro Cuore e AFAR, Roma, IRCCS San Raffaele Pisana, Centro per la cura e la diagnosi del Parkinson).

–  Descrizione delle procedure operative

–  Raccolta e criopreservazione di 96 campioni provenienti da pazienti affetti da BPCO, prelievi in entrata ed in uscita (plasma, siero linfociti). Raccolta e criopreservazione di 10 campioni di BAL.

–  Valutazione critica del ruolo delle varianti geniche del recettore nicotinico nell’aumento di rischio per dipendenza, insorgenza di tumore e ruolo nella terapia per la cessazione dal fumo di sigaretta. Varianti nei geni codificanti le sub-unità alfa 3-5 (rs1051730 e  rs16969968) sono specificamente associate alla dipendenza da nicotina, al maggiore rischio di insorgenza di tumore e influiscono la risposta ai farmaci utilizzati per la terapia per la cessazione dal fumo quali Bupropione e Vareniclina.

–  Valutazione critica della letteratura selezionata dell’attività dei farmaci antitumorali di origine marina. I metaboliti secondari prodotti daiCyanobacteria products sono il prototipo dal quale possono essere sviluppati nuovi farmaci.

– Valutazione critica della letteratura selezionata dell’ attività dei farmaci di origine naturale per terapia Alzheimer di. Galantamina e rivastigmina sono attualmente in terapia . Terapia con nicotina ha dato risultati promettenti e studi sono in corso per valutare il suo potenziale terapeutico

– Valutazione della letteratura selezionata  dei farmaci per terapia Alzheimer aventi come bersaglio il recettore alpha7 nicotinico. Diversi farmaci entrati in Fase II non sono passati alla fase III umana. I nostri risultati  sperimentali del dimostrano che il  Donepezil aumenta l’espressione proteica di alpha7 in linfociti umani e in cellule staminali neuronali umane.

– Valutazione critica della letteratura selezionata dei farmaci aventi come bersaglio i recettori nicotinici di tipo alpha9 e 10 come antidolorifici

– RgIA and Vc1.1 due peptidi originati dal Conus (cono peptidi) inducono analgesia sia a breve che a lungo termine.attraverso i meccanismi della risposta immune ed infiammatoria.  -Definizione critica del ruolo della nicotina in angiogenesi, proliferazione e apoptosi. La nicotina stimola gli eventi di angiogenesi e proliferazione ed inibisce i processi di apoptosi interagendo con i recettori nicotinici di tipo alpha-7  presenti anche sulle cellule non neuronali (epiteliali, endoteliali).

– Valutazione critica di una letteratura selezionata su meccanismi genetici quali varianti geniche coinvolte nell’insorgenza di BPCO, NSCLC e malattie geriatriche, e ruolo nella risposta alla terapia.

– Utilizzo di embrioni precoci di animali semplici, che fisiologicamente si sviluppano al di fuori del corpo materno (invertebrati marini, quali il riccio di mare Paracentrotus lividus), allo scopo di studiare i recettori colinergici. Esiste un’altissima percentuale di omologia fra le proteine strutturali di riccio e quelle umane.

– Valutazione critica della letteratura sul processo di “ageing”.

 

Caratterizzazione genotipica e fenotipizzazione molecolare della Bronco-Pneumopatia-Cronica-Ostruttiva (BPCO). Fase II: “Monitoraggio e valutazione degli effetti della riabilitazione respiratoria: applicazione di un approccio di System Medicine per l’implementazione di una piattaforma di informazioni cliniche, epidemiologiche e campioni biologici relativi all’eziologia, alla patogenesi e al trattamento di pazienti con insufficienza respiratoria.

 

Oggi in Italia e in Europa, le malattie del sistema respiratorio costituiscono la terza causa di morte dopo i tumori e le malattie cardiocircolatorie. Per la loro elevata incidenza e prevalenza, rappresentano una delle più frequenti cause di malattia e invalidità, comportando un notevole carico assistenziale per la società. Nel 2020, 11.9 milioni di decessi su 68 milioni a livello mondiale saranno causati da malattie polmonari (4.7 da BPCO, 2.5 da polmonite, 2.4 da TB e 2.3 da carcinoma polmonare). In termini di mortalità, incidenza, prevalenza e costi, le patologie polmonari si trovano al secondo posto a livello globale dopo le malattie cardiovascolari. In alcuni paesi (ad esempio il Regno Unito), esse costituiscono già la principale causa di decesso (fonte: European Lung Foundation, http://www.it.european-lung-foundation.org/425-patologie-polmonari.htm). Per quanto riguarda in particolare la situazione italiana, nel mese di gennaio 2008 il Ministero della Salute pubblica la “Relazione sullo stato Sanitario del Paese 2005-2006”, nella quale dichiara che le malattie respiratorie “rappresentano per numerosità la 3° causa di morte in Italia, dopo le malattie dell’apparato circolatorio e le neoplasie. La bronchite cronica e l’asma colpiscono più del 20% della popolazione di età superiore ai 65 anni e rappresentano per questa fascia di popolazione la terza causa di patologia cronica, dopo l’artrosi/artrite e l’ipertensione (ISTAT, 2003)”. Il 50% dei decessi per cause respiratorie è attribuibile alla BPCO (ISTAT, Cause di Morte, 2002, 2005), ma l’effetto più drammatico di questa patologia si evince quando si considera che nei prossimi decenni essa è destinata a divenire la quinta causa di disabilità a livello mondiale, valutata in termini di DALYs -disability-adjusted life years (OMS, Ginevra). “In età geriatrica infatti la BPCO grave si associa a comorbidità e contribuisce in maniera significativa alla perdita di autosufficienza ed alla fragilità dell’anziano, specialmente a causa di importanti limitazioni dello stato funzionale, deterioramento cognitivo, problemi comportamentali e alterazioni del tono dell’umore. E’ evidente, quindi, che la patologia respiratoria cronica ostruttiva ha un grande impatto socio-economico sull’individuo ma anche sull’intera società soprattutto a causa dei ricoveri ospedalieri e di terapie complesse e costose (compresa l’ossigenoterapia domiciliare a lungo termine e la ventiloterapia domiciliare). Anche utilizzando una stima conservativa, alla BPCO viene attribuito almeno il 6% dell’intera spesa sanitaria italiana, la quota maggiore è rappresentata dalle ospedalizzazioni” (Ministero della Salute, “Relazione sullo stato Sanitario del Paese 2005-2006”). Inoltre, in base al documento http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_pubblicazioni_1690_allegato.pdf  del Ministero della Salute nel 2011 (Pubblicazione a cura di Dir. Gen. della Programmazione sanitaria, Ufficio VI – Federalismo) in Italia ci sono stati 111.700 DRG attribuiti ad Insufficienza Respiratoria (quinto posto fra le cause di ricovero). Il fenomeno dell’invecchiamento della popolazione e l’aumentata esposizione ai principali fattori di rischio, quali il fumo di sigaretta e i componenti dell’inquinamento atmosferico, rendono l’incidenza delle malattie respiratorie in continua crescita. In questo contesto si colloca l’importanza di attuare programmi di riabilitazione respiratoria, universalmente accettati come parte integrante del trattamento clinico dei pazienti affetti da patologie respiratorie croniche, che, nonostante il trattamento medico standard, rimangono sintomatici e spesso limitati nelle attività della vita quotidiana. La riabilitazione respiratoria consiste, infatti, in un intervento globale e multidisciplinare basato sull’evidenza dei benefici sui pazienti in base a parametri di efficacia oggettivi e quantificabili, volto a ridurre i sintomi, ottimizzare lo stato funzionale, aumentare la partecipazione e ridurre il consumo di risorse sanitarie attraverso la stabilizzazione o il miglioramento della malattia. Evidenze scientifiche dimostrano la capacità dei programmi di riabilitazione respiratoria di apportare effetti benefici sulla dispnea e di migliorare il controllo di determinate patologie, come la Broncopneumopatia Cronica Ostruttiva (BPCO).

Obiettivi principali della riabilitazione in questi pazienti sono la prevenzione delle complicanze infettive e la riduzione dei tempi di degenza, favorendo quindi la transizione verso reparti a più basso livello assistenziale. I mezzi con cui si cerca di raggiungere ciò sono i cambiamenti di postura, le manovre di reclutamento alveolare, le tecniche di disostruzione bronchiale, l’allenamento dei muscoli respiratori, il ricondizionamento allo sforzo, lo svezzamento dalla ventilazione meccanica.

La complessità delle patologie trattate nei nostri reparti rende necessario un approccio di tipo sistemico che consente di tenere in considerazione e di integrare una molteplicità di fattori. Raramente, infatti, un singolo fattore è implicato come unico predittore dello sviluppo della patologia, piuttosto questa si evolve proprio dall’integrazione di più fattori concomitanti. Di conseguenza, in tali casi, si rivela maggiormente adatta una prospettiva sistemica che permette di prendere in esame una mole di dati notevole, provenienti da diverse fonti, al fine di formulare modelli computazionali che tengono conto di informazioni di diversa natura.

 

Obiettivi

Lo scopo della piattaforma riabilitativa consiste nell’implementare un database unico di informazioni cliniche volto al monitoraggio delle attività dei reparti. La grande disponibilità di dati consente di indagare e migliorare le prestazioni cliniche incentrando l’attenzione sui benefici della riabilitazione in termini di maggiore autonomia e maggiori capacità funzionali dei pazienti.

 

 

Validazione di biomarcatori molecolari di danno cromosomico e di suscettibilita’ genetica come predittori di malattia, di sopravvivenza e di efficacia nel trattamento riabilitativo

La misurazione del micronucleo (MN) frequenza nei linfociti del sangue periferico e nelle cellule esfoliate è una tecnica ampiamente utilizzata in epidemiologia molecolare e citogenetica per valutare la presenza e l'entità del danno cromosomico in popolazioni umane esposte ad agenti genotossici o con un profilo genetico di suscettibilita’. I MN si formano da frammenti di cromosoma o da cromosomi interi che non rimangono inclusi nei nuclei figli durante la divisione nucleare. La formazione di MN nelle cellule in divisione è il risultato di rotture cromosomiche dovute a lesioni del DNA non riparate o mal riparate, o di una segregazione anomala dei cromosomi a causa di un malfunzionamento mitotico. Tutti questi eventi possono provocare la formazione di MN, un’alterata espressione dei geni o aneuploidia. Tali effetti sono associati al fenotipo di instabilità cromosomica spesso osservato nel cancro (Bonassi et al., 2007). La maggior parte di queste evidenze nascono dallo studio della formazione di MN nei linfociti, ma la stretta associazione tra questo endpoint e lo stesso evento studiato in cellule esfoliate, permette di applicare gli stessi modelli di entrambe le condizioni.

Lo studio viene condotto per valutare l'ipotesi che la frequenza di MN in linfociti sia predittiva al trattamento riabilitativo.

Il test della cometa è una tecnica in grado di valutare il danno al DNA in cellule singole sia in ciclo riproduttivo che in quiescenza. Richiede piccoli campioni di sospensione cellulare ed i risultati si possono ottenere in pochi giorni. Tale tecnica  utilizza una microelettroforesi per visualizzare il danno al DNA in singole cellule. Le cellule, imprigionate in uno strato di agarosio e lisate, vengono sottoposte ad elettroforesi. Durante l’elettroforesi gli eventuali frammenti di DNA migrano dal nucleo verso l’anodo della camera elettroforetica fornendo al microscopio ottico l’immagine di una cometa, da qui poi il nome “Comet Test”. Poiché le rotture su singolo filamento e su siti alcali labili, indotte da agenti genotossici, sono più frequenti di quelle evidenziabili su doppio filamento, questa versione ha offerto un grande incremento della sensibilità del metodo.

Il comet test può essere utilizzato per analizzare il danno al DNA in diversi tipi di cellule eucariote. Le cellule umane più frequentemente usate sono i linfociti, che oltre a risultare facilmente reperibili, presentano il vantaggio di costituire una popolazione cellulare sincronizzata nella fase G0 del ciclo cellulare. Inoltre hanno un’emivita sufficientemente lunga per permettere di essere impiegati negli studi di esposizione occupazionale ed ambientale. La tecnica SCGE può essere applicata per studi di genotossicità anche in altre popolazioni cellulari diverse dai linfociti, come ad esempio cellule epiteliali, cellule di sfaldamento vescicale, ecc.

La valutazione del comet test si esegue attraverso l’utilizzo di parametri caratterizzanti la cometa: “tail lenght”, ovvero la lunghezza della coda in µm, “tail intensity” ovvero la percentuale di DNA migrata nella coda che si basa sull’intensità di fluorescenza presente nella coda stessa. Questo parametro detto “tail moment” è definito come il prodotto fra la percentuale del DNA nella coda e la lunghezza della coda considerata dal centro della testa.

Il comet test offre dei vantaggi in quanto è sufficientemente sensibile nel riconoscere danni al DNA in singole cellule (rotture in singolo filamento, mal riparazioni, apoptosi) e presenta una relativa semplicità e rapidità di esecuzione. Un altro grosso vantaggio è l’uso di quantità di cellule campione estremamente basse. Questo metodo, inoltre, può dare informazioni di genotossicità diretta come dare informazioni sull’abilità di composti epigenetici e genotossici indiretti che interferiscono nei processi di riparo del danno subito.

Il come test rivela non solo rotture al DNA ma anche la presenza di cellule apoptotiche. L’apoptosi è il processo attraverso cui gli organismi eliminano le cellule danneggiate, precancerose o in eccesso. E’ caratterizzata da una serie di alterazioni distinguibili morfologicamente che includono condensazioni, frammentazioni e fagocitosi. E’ un evento programmato geneticamente che richiede trascrizione genica attiva. La cellula che subisce danni citotossici muore per apoptosi. Nel comet test la cellula apoptotica appare come una nuvola (cloud) senza testa e con la coda dovuta ad un’elevata frammentazione del DNA.

Lo studio viene condotto per valutare l'ipotesi che la lunghezza delle code sia predittiva al trattamento riabilitativo.

Nel servizio di Epidemiologia clinica e molecalare è in funzione la piattaforma di scansione Metafer  in grado di automatizzare un'ampia varietà di applicazioni in microscopia, basate sull'analisi di immagine. Grazie alla modularità e alla flessibilità del Sistema, è applicabile in diverse applicazioni, quali diagnostica citogenetica, ematologia, patologia, tossicologia, scienze forensi, e molte altre.

Facile da usare

La scansione dei vetrini è facile con Metafer. Sono disponibili diversi moduli software che consentono di personalizzare e standardizzare il tipo di analisi di immagine di interesse, includendo inoltre gli opportuni strumenti di revisione a schermo.  Il microscopio può inoltre essere utilizzato nel modo convenzionale, nonchè essere utilizzato per rilocalizzare e ricontrollare in live ogni singolo elemento di interesse precedentemente acquisito e visualizzato in opportune gallerie di immagini. L'operazione di rilocalizzazione è immediata ed è eseguita semplicemente cliccando con il mouse sull'elemento di interesse presente nella galleria.

Flessibilità

Ogni campione in microscopia è differente; l'automazione dell'analisi quindi richiede il giusto livello di flessibilità, escludendone però la soggettività. Metafer si basa su profili di scansione personalizzabili da parte degli operatori, chiamati "classificatori", che definiscono precisamente gli algoritmi dell'analisi; e con la selezione di un altro classificatore, il Sistema è già pronto per il prossimo esperimento.

Modularità

Metafer può crescere nel tempo. Sia i software che gli hadrware sono modulari, e in caso di aumento del carico di lavoro il livello di automazione può essere aumentato; opzioni disponibili sono il caricatore automatico dei vetrini (SlideFeeder), il modulo di lettura automatica del barcode, e il dispositivo di dispensamento utomatico dell'olio da immersione.

 

 

 

Pubblicazioni

recenti

 

 

 

 

Tobacco Smoking: Risk to Develop Addiction, Chronic Obstructive Pulmonary Disease, and Lung Cancer.Santoro A, Tomino C, Prinzi G, Lamonaca P, Cardaci V, Fini M, Russo P. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 2019;14(1):39-52. doi: 10.2174/1574892814666190102122848.

Shorter telomere length in schizophrenia: Evidence from a real-world population and meta-analysis of most recent literature.Russo P, Prinzi G, Proietti S, Lamonaca P, Frustaci A, Boccia S, Amore R, Lorenzi M, Onder G, Marzetti E, Valdiglesias V, Guadagni F, Valente MG, Cascio GL, Fraietta S, Ducci G, Bonassi S.Schizophr Res. 2018 Dec;202:37-45. doi: 10.1016/j.schres.2018.07.015. Epub 2018 Jul 9.

Pharmacological Management of Chronic Obstructive Lung Disease (COPD). Evidence from a Real-World Perspective.Kisialiou A, Prinzi G, Lamonaca P, Cardaci V, Fini M, Bonassi S, Russo P.Curr Med Chem. 2018 Oct 30. doi: 10.2174/0929867325666181031101128. [Epub ahead of print]

Cognitive Impairment in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD): Possible Utility of Marine Bioactive Compounds.Prinzi G, Santoro A, Lamonaca P, Cardaci V, Fini M, Russo P.Mar Drugs. 2018 Sep 4;16(9). pii: E313. doi: 10.3390/md16090313. Review.

Pharmacological Management of Chronic Obstructive Lung Disease (COPD). Focus on Mutations. Russo P, Lococo F, Kisialiou A, Prinzi G, Lamonaca P, Cardaci V, Fini M. Curr Med Chem. 2018 May 31. doi: 10.2174/0929867325666180601100235. [Epub ahead of print]

Flavonoids and Reduction of Cardiovascular Disease (CVD) in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Russo P, Prinzi G, Lamonaca P, Cardaci V, Fini M. Curr Med Chem. 2018 May 13. doi: 10.2174/0929867325666180514100640. [Epub ahead of print]

Clinical and genomic safety of treatment with Ginkgo biloba L. leaf extract (IDN 5933/Ginkgoselect®Plus) in elderly: a randomised placebo-controlled clinical trial [GiBiEx]. Bonassi S, Prinzi G, Lamonaca P, Russo P, Paximadas I, Rasoni G, Rossi R, Ruggi M, Malandrino S, Sánchez-Flores M, Valdiglesias V, Benassi B, Pacchierotti F, Villani P, Panatta M, Cordelli E. BMC Complement Altern Med. 2018 Jan 22;18(1):22. doi: 10.1186/s12906-018-2080-5.

Action plans and coping strategies in elderly COPD patients influence the result of pulmonary rehabilitation: an observational study. Russo P, Prinzi G, Kisialiou A, Cardaci V, Stirpe E, Conti V, Fini M, Bonassi S. Eur J Phys Rehabil Med. 2017 Apr 14. doi: 10.23736/S1973-9087.17.04501-4. [Epub ahead of print]

Metabolic Disorder in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) Patients: Towards a Personalized Approach Using Marine Drug Derivatives. Lamonaca P, Prinzi G, Kisialiou A, Cardaci V, Fini M, Russo P. Mar Drugs. 2017 Mar 20;15(3). pii: E81. doi: 10.3390/md15030081. Review.

Effect of Genetic Polymorphisms (SNPs) in CHRNA7 Gene on Response to Acetylcholinesterase Inhibitors (AChEI) in Patients with Alzheimer's Disease. Russo P, Kisialiou A, Moroni R, Prinzi G, Fini M. Curr Drug Targets. 2017;18(10):1179-1190. doi: 10.2174/1389450116666151001111826. Review.

New Drugs from Marine Organisms in Alzheimer's Disease.Russo P, Kisialiou A, Lamonaca P, Moroni R, Prinzi G, Fini M. Mar Drugs. 2015 Dec 25;14(1):5. doi: 10.3390/md14010005. Review.

Novel therapeutic strategy in the management of COPD: a systems medicine approach. Lococo F, Cesario A, Del Bufalo A, Ciarrocchi A, Prinzi G, Mina M, Bonassi S, Russo P. Curr Med Chem. 2015;22(32):3655-75. Review.